液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)25-羥維生素D標(biāo)準(zhǔn)化專家共識(shí)

中國老年保健醫(yī)學(xué)研究會(huì)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)分會(huì), 中國老年醫(yī)學(xué)學(xué)會(huì)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)分會(huì)
中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志, 2021, 44(7): 587-595

臨床血清維生素D檢測(cè)方法主要為化學(xué)發(fā)光免疫分析法（chemiluminescent immunoassay，CLIA）和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatography- tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）。從檢測(cè)原理出發(fā)，LC-MS/MS是基于被測(cè)生物標(biāo)志物本身分子量、結(jié)構(gòu)等化學(xué)性質(zhì)的直接分析法，因此具有獨(dú)特高靈敏度、高特異性和高通量特點(diǎn)。CLIA是基于抗原抗體反應(yīng)，與LC-MS/MS相較，前處理簡(jiǎn)單且檢測(cè)自動(dòng)化程度高，但存在特異性低、線性范圍窄和檢測(cè)結(jié)果可比性差等問題。

目前LC-MS/MS檢測(cè)25-羥維生素D［25(OH)D］的方法大多為實(shí)驗(yàn)室自建方法，雖然已有多類質(zhì)譜檢測(cè)試劑盒陸續(xù)上市，但方法缺乏標(biāo)準(zhǔn)化。另外，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的缺乏或不適當(dāng)使用、質(zhì)量保證措施的不完整均可導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的偏差甚至錯(cuò)誤。LC-MS/MS檢測(cè)血清25(OH)D方法的標(biāo)準(zhǔn)化是其在臨床實(shí)驗(yàn)室成功應(yīng)用的必要條件，也是保證方法之間一致性和可比性的核心要素。本專家共識(shí)旨在建立標(biāo)準(zhǔn)化的血清25(OH)D檢測(cè)方法，從標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和內(nèi)標(biāo)物的選擇、儀器與試劑的準(zhǔn)備、檢測(cè)方法注意事項(xiàng)、質(zhì)量控制管理、人員要求及參考區(qū)間等方面提出建議。

術(shù)語及定義

1. 25(OH)D：人體血液中維生素D的主要循環(huán)形式包括25(OH)D2和25(OH)D3，其中25(OH)D3為主要存在形式，因其穩(wěn)定性好，可作為評(píng)價(jià)人體維生素D水平的可靠指標(biāo)。

2. 內(nèi)標(biāo)：加入到待測(cè)樣品中，作為測(cè)定待測(cè)組分含量的參照標(biāo)準(zhǔn)及其已知質(zhì)量或含量純物質(zhì)。

3. 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：具有足夠均勻且穩(wěn)定的特定特性物質(zhì)，其特性適用于測(cè)量及標(biāo)稱特性檢查的用途。

4. 有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：附有由權(quán)威機(jī)構(gòu)發(fā)布文件，提供使用有效程序獲得且具有不確定度和溯源性的一個(gè)或多個(gè)特性值標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

5. 定量下限（limit of quantitation， LOQ）：在規(guī)定的測(cè)量條件下，以指定的測(cè)量不確定度能測(cè)量的樣品中可被測(cè)量的最低值。

維生素D主要代謝路徑

人體維生素D主要來源于皮膚經(jīng)陽光作用合成的維生素D₃，另一種來源是食物中（如經(jīng)光照后的蘑菇、野生海魚等）的維生素D₂，兩者通過肝臟代謝后以2種形式存在，分別是25(OH)D₂和25(OH)D₃，雖然人體血液中超過95%的25(OH)D為25(OH)D₃，但仍存在少量25(OH)D₂，若補(bǔ)充外源性25(OH)D₂，則體內(nèi)可檢測(cè)出濃度較高的25(OH)D₂，因此需分別對(duì)25(OH)D₂和25(OH)D₃進(jìn)行定量檢測(cè)。25(OH)D在腎臟和其他組織中轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂猩锘钚缘亩u基代謝物1，25-羥基維生素D［1，25-(OH)₂D］，該物質(zhì)經(jīng)過維生素D結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至靶器官，與維生素D受體結(jié)合，從而發(fā)揮其生理作用（圖1）。1，25-(OH)₂D在人體內(nèi)的濃度低（pg/ml級(jí)別）、半衰期短，檢測(cè)難度較大，而25(OH)D因其濃度高、穩(wěn)定、半衰期較長(zhǎng)，是反映機(jī)體維生素D代謝的重要檢測(cè)指標(biāo)。

圖1 維生素D代謝途徑

LC-MS/MS技術(shù)

LC-MS/MS是通過質(zhì)量分析器測(cè)定帶電粒子質(zhì)荷比的一種分析技術(shù)；MS/MS是將2個(gè)質(zhì)量分析器由碰撞室串接起來的分析設(shè)備，即三重四極桿質(zhì)譜儀。第一級(jí)質(zhì)量分析器篩選出被離子化的樣本中特定質(zhì)荷比的母離子，母離子進(jìn)入碰撞室，通過碰撞誘導(dǎo)解離的方式形成碎片子離子；第二級(jí)質(zhì)量分析器篩選出特異性強(qiáng)的定量子離子及定性子離子，子離子進(jìn)入檢測(cè)器監(jiān)測(cè)，最終得到目標(biāo)分析物的含量。每個(gè)母離子/子離子對(duì)被稱為1個(gè)離子對(duì)，只有具有特定離子對(duì)的待測(cè)物質(zhì)，才能進(jìn)入檢測(cè)器。因此，MS/MS具有很好的檢測(cè)特異性。此外，質(zhì)譜方法具有同時(shí)監(jiān)測(cè)多離子通道多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，即使在檢測(cè)背景信號(hào)高的內(nèi)源性化合物時(shí)，亦可通過同時(shí)監(jiān)測(cè)2個(gè)離子碎片通道，實(shí)現(xiàn)待測(cè)物質(zhì)的精準(zhǔn)檢測(cè)。

關(guān)鍵質(zhì)量要素

1.標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的選擇

具有溯源性的有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是實(shí)現(xiàn)量值溯源、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確一致的重要保證。應(yīng)選用國家級(jí)權(quán)威機(jī)構(gòu)有的證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，若不可獲得相關(guān)權(quán)威機(jī)構(gòu)或國際公認(rèn)的有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，則其他獲得相關(guān)國家認(rèn)可委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)者認(rèn)可的提供明確溯源途徑和測(cè)量不確定度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可作為替代選擇。

2.內(nèi)標(biāo)物的選擇

1）內(nèi)標(biāo)物的作用

內(nèi)標(biāo)物可用于校正基質(zhì)效應(yīng)以及樣本前處理、色譜分離和離子化過程引入的偏差，有助于提高定量分析的準(zhǔn)確度和精密度。

2）推薦內(nèi)標(biāo)

推薦使用25(OH)D的穩(wěn)定同位素標(biāo)記物作為內(nèi)標(biāo)品，一般有：氘代或¹³C同位素內(nèi)標(biāo)。

3）內(nèi)標(biāo)物要求

內(nèi)標(biāo)物至少比目標(biāo)分析物大3個(gè)分子量。內(nèi)標(biāo)物化學(xué)純度≥98%，同位素標(biāo)記純度≥97%，如果低于該純度，則其未標(biāo)記的化合物濃度會(huì)與25(OH)D₂或25(OH)D₃的檢測(cè)下限接近，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果系統(tǒng)性偏高。必要時(shí)應(yīng)對(duì)內(nèi)標(biāo)物純度進(jìn)行測(cè)試，以避免其中含有與目標(biāo)分析物共洗脫且具有相同質(zhì)量數(shù)的干擾物質(zhì)。

注：因25(OH)D₂-d₆[m+1]⁺(m/z 419)脫水形成的子離子(m/z 401)與25(OH)D₃的分子離子峰[m+1]⁺(m/z 401)有相同質(zhì)荷比，易與25(OH)D₃特別是其異構(gòu)體3-epi-25(OH)D₃檢測(cè)發(fā)生干擾，一般建議在使用氘代內(nèi)標(biāo)時(shí)選用25(OH)D₂-d₃作為內(nèi)標(biāo)。

3.樣本前處理方法的選擇

生物樣本分析的主要障礙包括濃度低、干擾大、個(gè)體差異大等，樣品處理目的主要是去除樣品中的雜質(zhì)，富集樣品。針對(duì)血清25(OH)D的檢測(cè)，如果儀器靈敏度高，蛋白沉淀法可作為首選的樣品處理方法，具有耗時(shí)少，簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，但需要進(jìn)行適當(dāng)?shù)纳V分離，以減少基質(zhì)效應(yīng)。固液萃?。╯olid liquid extraction， SLE）和固相萃取法（solid phase extraction， SPE）雖然可以去除樣品的基質(zhì)及富集樣品，但其洗脫效率容易受到洗脫耗材批次差異的影響，需要進(jìn)行不同廠家及不同批次的比對(duì)。

4.色譜條件選擇

根據(jù)被測(cè)化合物的特性，進(jìn)行流動(dòng)相的優(yōu)化，盡量避免使用非揮發(fā)性鹽、無機(jī)酸、表面活性劑等流動(dòng)相添加劑，盡量不用或少用極低濃度（< 0.02%）的流動(dòng)相添加劑。此外，25(OH)D₃與3-epi-25-羥基維生素D₃［3-epi-25(OH)D₃］為同分異構(gòu)體。在學(xué)齡兒童體內(nèi)，3-epi-25(OH)D₃占25(OH)D的2.5%~17%，在出生后前3個(gè)月嬰兒體內(nèi)，3-epi-25(OH)D₃濃度較高，占25(OH)D濃度的60%，在成人中占比較低，偶爾可高達(dá)22%。25(OH)D₃與3-epi-25(OH)D3質(zhì)荷比一致，導(dǎo)致無法通過質(zhì)譜直接分離，一般可通過色譜分離的方式使這2種分析物具有不同保留時(shí)間；當(dāng)分離度達(dá)到1.5時(shí)，可忽略3-epi-25(OH)D₃對(duì)25(OH)D₃檢測(cè)的影響。如果需要進(jìn)行3-epi-25(OH)D₃的分離，則需確保色譜條件可以實(shí)現(xiàn)其與25(OH)D₃的基線分離，參考譜圖見圖2。

圖2 25(OH)D2和25(OH)D3檢測(cè)色譜圖

5.質(zhì)譜參數(shù)選擇

LC-MS/MS定量分析推薦一個(gè)分析物使用2個(gè)離子通道，分別作為定量離子通道和定性離子通道。25(OH)D₂和25(OH)D₃是水解代謝產(chǎn)物，熱不穩(wěn)定及離子化過程中也容易形成脫水子離子。需要注意的是其在基質(zhì)中的背景噪音偏高，應(yīng)避免選擇脫水的子離子碎片（即母離子減少18的碎片離子）。但如果大氣壓化學(xué)電離源作為離子化模式，其在離子源中完全脫水形成穩(wěn)定的脫水離子可以作為母離子。在任何給定時(shí)間內(nèi)監(jiān)測(cè)到的離子對(duì)通道越多，單個(gè)色譜峰可采集到的數(shù)據(jù)點(diǎn)就越少，如果用于表征色譜峰面積的數(shù)據(jù)點(diǎn)數(shù)量不足，數(shù)據(jù)的可靠性可能會(huì)受到影響，掃描時(shí)間單個(gè)色譜峰包含至少10個(gè)（建議15～20個(gè)）數(shù)據(jù)點(diǎn)。此外，優(yōu)化離子通道內(nèi)延遲時(shí)間，以避免碎片離子間發(fā)生交叉干擾。初步確定碰撞池電壓和碰撞池能量后，建議使用提取樣本進(jìn)樣以獲得基質(zhì)樣本中最佳信噪比的碎片離子。

25(OH)D檢測(cè)

1.試劑

（1）二類25-羥維生素D檢測(cè)試劑盒：可溯源至可獲得的最高級(jí)別標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線：建議25(OH)D2的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍至少包含2～100 ng/mL區(qū)間，25(OH)D₃的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍至少包含5～250 ng/mL區(qū)間，并且在選定的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)一般分散設(shè)置4～5個(gè)濃度點(diǎn)。

（3）質(zhì)控樣本：?jiǎn)为?dú)配制質(zhì)控樣本的初級(jí)工作液。質(zhì)控樣本基質(zhì)應(yīng)盡量和患者樣本基質(zhì)保持一致，以減小樣本處理和離子化中的基質(zhì)效應(yīng)。建議配制2～3個(gè)濃度質(zhì)控樣本，濃度范圍建議在臨床參考區(qū)間的基礎(chǔ)上（分布于正常和異常參考區(qū)間），結(jié)合分析方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線綜合設(shè)定，通常為標(biāo)準(zhǔn)曲線中3倍左右的LOQ、中間濃度±20%和70%～80%的定量上限，以確保不同濃度未知樣本的準(zhǔn)確性。

2.樣本要求

本方法適用于新鮮、冷凍或凍干血清樣本的25(OH)D₂和25(OH)D₃濃度檢測(cè)。

3.參考區(qū)間

注：“-”表示引文中無此項(xiàng)內(nèi)容。

4.報(bào)告發(fā)布

根據(jù)《GB/T 22576.1-2018/ISO 15189：2012》進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果的報(bào)告發(fā)布，報(bào)告前綜合評(píng)估：質(zhì)控是否在控，與此前結(jié)果是否一致，樣本質(zhì)量等因素進(jìn)行綜合考量。此外，建議各實(shí)驗(yàn)室報(bào)告單上分別顯示25(OH)D2、25(OH)D3和25(OH)D的含量。

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